Trang Chính
Portal
Tìm kiếm
Latest images
Đăng ký
Đăng Nhập
Kỹ thuật tách chiết protein
* Các dung dịch stock
1. Urea 11 M:
Pha 39,6 g urea trong 60 mL nước cất vô trùng bằng cách cho từ từ urea vào 20 mL nước, đánh tan trên máy khuấy từ, sau khi tan hết (khoảng 2 giờ) định mức lên 60 mL.
Chú ý không để urea ở nhiệt độ trên 300C, bảo quản dung dịch stock ở -200C.
2. Tris - HCl 1,5 M pH 8,8
Pha 3,64 g Tris trong 15 mL nước cất vô trùng, chỉnh pH 8,8 với HCl, định mức lên 20 mL bằng nước cất vô trùng.
3. EDTA 0,25 M pH 8
Pha 4,2 g EDTA trong khoảng 40 mL nước cất vô trùng, chỉnh pH 8 với NaOH khan, định mức 50 mL bằng nước cất vô trùng.
* Đệm chiết
1. Đệm dẫn theo Kang và cs [8]
Nồng độ Pha trong 20 mL đệm
HEPES 50 mM 0,238 g
Potassium acetate 10 mM 0,019 g
Magnesium acetate 5 mM 0,014 g
EDTA 1 mM 136 L EDTA 0,25 M.
DTT 1 mM 0,003 g
PMSF 2 mM 0,007 g
2. Đệm PBS [1]
NaCl 8 g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,44 g
KH2PO4 0,24 g
Pha trong 1 lít dung dịch, pH 7,4 (NaOH).
3. Đệm Gabriel và Ellingboe (1982) [7]
Tris/HCl 50 mM
MgCl2 0,5 mM
Na2-EDTA 1 mM
SDS 2%
Dithiothreiton (DTT) 50 mM
pH 7,8.
4. Đệm Arakawa (1997) [10]
Nồng độ Pha trong 20 mL đệm
Tris - HCl (pH 8,0) 200 mM 4 mL Tris 1 M
NaCl 100 mM 0,12 g
Sucrose 400 mM 2,47 g
EDTA 10 mM 0,8 mL EDTA 0,25 M
2 - mercaptoethanol 14 mM 15,58 L
PMSF 1 mM 4,84 mg
Tween 20 0,05% 10 L
* Các dung dịch khác
1. TCA acetone [6]
Trichloacetic acid 10% 10 g
2 - mercaptoethanol 0,07% 0,07 mL
Hòa tan và định mức 100 mL bằng acetone, bảo quản ở 4oC.
2. Đệm rửa mẫu [6]
2 - mercaptoethanol 0,07% 0,07 mL
Acetone 100 mL
Bảo quản ở 4oC.
* Các bước tiến hành [6], [7]
Đối với mẫu lá, lá cây được chọn từ ruộng, rửa sạch và cắt nhỏ sau đó để trong tủ lạnh -860C khoảng 1 ngày trước khi tách chiết (0,3 g lá/mẫu).
Nghiền thật mịn mẫu lá bằng chày và cối sứ (cối và chày sứ đều được làm lạnh từ trước cùng với mẫu lá) trong 1 mL đệm chiết. Sau khi nghiền, mẫu được chuyển qua các tube eppendorf 1,5 mL và được ly tâm với tốc độ 15.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Sau khi ly tâm, kết tủa bị loại bỏ, phần dịch nổi có chứa protein được chuyển qua 1 tube khác. Mẫu sau khi ly tâm được bảo quản ở -200C.
Đối với hạt có chứa tinh bột, các bước tiến hành cũng giống như mẫu lá, tuy nhiên dịch nổi sau khi ly tâm lần thứ nhất được đun ở 950C trong vòng 5 phút, tiếp tục ly tâm 15.000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ tủa tinh bột, thể nổi có chứa protein được giữ lại.
* Tinh sạch protein [6]
Với các mẫu bị lẫn tạp chất hay nồng độ protein thấp có thể tinh sạch bằng cách cho TCA - acetone vào mẫu, vortex nhẹ, để lắng ở -20oC trong khoảng 30 phút. Mẫu sau đó được ly tâm nhẹ khoảng 1.000 vòng/phút trong khoảng 30 giây, loại bỏ nổi. Cho thêm acetone có chứa 2 mercaptoethanol vào mẫu, vortex nhẹ và thực hiện như bước trên, làm như vậy nhiều lần cho đến khi thấy mẫu có màu trắng. Làm khô mẫu bằng máy làm khô chân không, hòa tan mẫu trở lại với lượng đệm phù hợp.
* Xác định hàm lượng protein tổng số [4]
Dịch nổi có chứa protein được đo độ hấp thụ quang trên máy quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm (mẫu trắng là đệm chiết protein).
Nồng độ protein tổng số được tính theo công thức của Schlef và Wensink (1981).
PC (mg/ml) = 1,5 x A280 – 0,75 x A260
Trong đó:
PC : nồng độ protein
A280 : độ hấp thụ quang ở bước sóng 280 nm
A260 : độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm
SDS Electrophoresis protocol
* Hóa chất
1. Acrylamide 30%
Acrylamide 29 g
Bisacrylamide 1 g
Định mức 100 mL bằng nước cất 2 lần
Bảo quản 4oC
2. Tris 2 M (pH 8,
Tris base 121 g
Nước cất 2 lần 300 mL
Chỉnh pH = 8,8 bằng HCl đậm đặc
Định mức 500 ml bằng nước cất 2 lần
3. SDS 10%
SDS 10 g
Định mức 100 mL với nước cất 2 lần
4. APS 10%
APS 1g
Định mức 10 mL với nước cất 2 lần
5. TEMED
Bảo quản ở 4oC
6. 4X separating gel pH 8,8
Tris 2M pH 8,8 75 mL
SDS 10% 4 mL
Định mức 100 mL với nước cất 2 lần
7. 4X stacking gel pH 6,8
Tris 2M pH 8,8 25 mL
Nước cất 2 lần 25 mL
Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc
SDS 10% 4 mL
Định mức 100ml với nước cất 2 lần
8. 2X SDS sample buffer
Tris 2M pH 8,8 6,25 mL
Nước cất 2 lần 30 mL
Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc
SDS 4 g
Glycerol 20 mL
β- mercaptoethanol 10 mL
Bromophenol blue 0,2 g
Định mức với nước cất 2 lần tới 100 mL
Bảo quản ở -20oC
9. 10X Electrophresis buffer pH 8,3
Tris base 30 g
Glycine 144 g
SDS 10 g
Nước cất 2 lần 1000 mL
Chỉnh pH = 8,3 bằng HCl đậm đặc
10. Gel staining
Coomassie brilliant blue R250 2,5 g
Methanol 450 mL
Glacial acid acetic 100 mL
Nước cất 2 lần 450 mL
11. Gel destaining
Methanol 300 mL
Glacial acetic acid 100 mL
Nước cất 2 lần 600 mL
* Các bước tiến hành
1. Đổ gel
Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất.
Bước 2: Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thật sạch bằng nước cất. Gắn các tấm kính vào giá đỡ. Thử độ thấm lắp ghép bằng nước cất, nếu nước chảy ra từ khe ghép nhiều thì phải làm lại.
Bước 3: Pha dung dịch separating gel 12%.
Chạy 1 chiều Chạy 2 chiều
DW 1,68 mL 2,94 mL
Acrylamide 1,92 mL 3,36 mL
Separating buffer 1,2 mL 2,1 mL
TEMED 6 L 8 L
APS 30 L 35 L
Vortex khoảng 1 - 2 phút, đổ nhanh vào giữa 2 tấm kính đã chuẩn bị sẵn lên đến hơn 3/4 độ cao tấm kính. Cho nhanh nước cất vô trùng vào bên trên gel. Sau khi đông (kiểm tra bằng dung dịch thừa ở ngoài hoặc thấy vạch phân cắt ở 2 pha trên gel), nghiêng gel lại cho nước chảy ra hết và làm khô bề mặt gel bằng giấy thấm.
Bước 4: Pha dung dịch stacking gel 5%
DW 0,88 mL
Acrylamide 260 L
Stacking buffer 380 L
TEMED 2 L
APS 12 L
Vortex khoảng 1 phút, đổ nhanh vào giữa 2 tấm kính, bên trên separating gel cho hết độ cao tấm kính. Cẩn thận đặt lược vào giữa 2 tấm kính sao cho không có bọt khí. Theo dõi gel đông, cứ khoảng 2 phút dùng pipette thêm stacking gel vào phía trên lược để bổ sung lương gel bị chảy ra ngoài (nếu có).
2. Chuẩn bị mẫu
Bước 5: Tính toán lấy 1 mẫu chứa khoảng 30 mg protein và 5 mL sample buffer, tổng thể tích mẫu khoảng 30 mL.
3. Chạy điện di
Bước 6: Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập bằng đệm chạy (1X Electrophoresis buffer). Chú ý không để bọt khí ở phía dưới tấm kính, dùng pipette làm sạch gel thừa trong các giếng. Chạy prerun khoảng 5 phút ở 80 - 100 V.
Bước 7: Dùng Hamilton syringe load mẫu vào các giếng, cẩn thận để mẫu không bị tràn ra ngoài.
Bước 8: Chạy điện di ở điện thế 80 - 100 V trong khoảng từ 1,5 - 2,5 giờ cho đến khi vạch màu đi hết độ dài tấm kính (thời gian thay đổi tùy theo mẫu).
4. Nhuộm và rửa gel
Bước 9: Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm (thường là các hộp nhựa) có chứa dung dịch gel staining, lắc nhẹ khoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10 - 15 phút.
Bước 10: Rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ, khoảng 10 phút thay dung dịch rửa 1 lần cho đến khi hoàn thành.
2 D Electrophoresis protocol
(for IPG ReadyStrip pH 4-7, 7 cm)
* Hóa chất
1. Sample solution [9]
25 mL 1 mL
Urea 13,5 g 820 mL 11 M
Trixton - 100 0,13 mL 5,5 mL
2 - mercaptoethanol 0,5 mL 20 mL
Amphalyte 0,5 mL 20 mL
DW Định mức 25 mL 135 mL
Pha 1 mL cho khoảng 6 mẫu, cho thêm vài hạt Bromophenol Blue (BPB) và bảo quản ở -200C (có thể đến 2 tháng).
2. Rehydration solution [2], [3]
Nồng độ 1 mL
Urea 9 M 820 mL 11 M
Trixton - 100 0,5% 5 mL
Amphalyte 0,15% 3,75 mL
DTT 10 mM 1,5 mg
DW 170 mL
Pha ngay trước khi dùng, 1 mL đệm cho 1 - 3 thanh strip.
3. Equilibration buffer [2], [3]
Nồng độ 2,5 mL
Urea 6 M 1.400 mL 11 M
Tris - HCl 0,375 M 625 mL 1,5 M
Glycerol 20% 500 mL SDS 2% 50 mg
Đối với Equilibration solution 1, thêm 50 mg DTT (130 mM)
Đối với Equilibration solution 2, thêm 62,5 mg Iodoacetamide (135 mM).
Pha ngay trước khi dùng, sử dụng 2,5 mL mỗi loại cho mỗi thanh strip.
* Các bước tiến hành [3], [5]
Ngày 1 (có thể chuẩn bị từ trước):
1. Pha các dung dịch stock.
2. Pha các hóa chất cần thiết.
3. Chuẩn bị mẫu.
Ngày 2:
4. Kiểm tra mẫu bằng điện di SDS 12% acrylamide, chọn mẫu tốt để chạy điện di 2 chiều.
5. Pha đệm trương nước (Rehydration buffer). Tiến hành vào khoảng 15h30 đến 16h00 chiều.
6. Ngâm trương nước thanh strip.
Bước 1. Rửa sạch khay trương nước (Rehydration tray) bằng cồn và nước cất 2 lần.
Bước 2. Dùng pipette cho khoảng 300 - 1000 l đệm trương nước vào khay trương nước.
Bước 3. Lấy thanh strip ra khỏi tủ -200C, cẩn thận dùng panh tách lớp phim bảo vệ trên thanh strip sau đó đặt vào khay đã có sẵn đệm trương nước. Chú ý đặt mặt gel xuống dưới một cách nhẹ nhàng, nếu phía dưới gel có bọt khí phải dùng panh giữ 1 đầu thanh strip, nâng lên hạ xuống nhẹ nhàng cho bọt khí ra hết.
Bước 4. Đậy nắp khay (hoặc phủ dầu khoáng), ngâm qua đêm ở 200C.
Ngày 3:
7. Chạy chiều IEF
Bước 5. Chuẩn bị mẫu, tỷ lệ mẫu : sample loading ít nhất là 1:4 (nếu trong mẫu có nhiều muối thì tỷ lệ này phải cao hơn, thường là 1:5) và tổng thể tích không vượt quá 200 L.
Bước 6. Chuẩn bị một miếng giấy thấm khô và một miếng giấy thấm được làm ẩm (tốt nhất là giấy 3M). Chuẩn bị 2 miếng giấy wick được làm ẩm bằng nước cất 2 lần.
Bước 7. Dùng panh nhấc 1 đầu của thanh strip ra khỏi khay trương nước, giữ theo chiều thẳng đứng vài giây cho đệm thừa chảy ra hết. Sau đó đặt thanh strip lên miếng giấy thấm khô (mặt phim xuống dưới) và đặt miếng giấy thấm ẩm lên trên mặt gel của thanh trong vài giây để hút hết đệm thừa.
Bước 8. Đặt thanh strip vào focusing tray 24 cm (mặt phim xuống dưới), chỉnh vị trí của thanh sao cho đúng vị trí điện cực, cẩn thận tránh nhầm cực.
Bước 9. Cẩn thận đặt 2 miếng wick vào 2 đầu của thanh strip ở vị trí khoảng 5 mm tính từ mép của gel ở trên mỗi đầu (với các miếng wick nhỏ có thể dùng nhiều miếng).
Bước 10. Đặt các điện cực di động vào vị trí tương ứng của wick và gel ở 2 đầu thanh strip, luôn đảm bảo điện cực không nằm phía ngoài gel và wick nằm giữa gel và điện cực.
Bước 11. Cẩn thận đặc các giếng lên thanh strip ở vị trí sát điện cực âm sao cho vừa không làm hỏng gel vừa không tạo kẽ hở để mẫu chảy ra ngoài.
Bước 12. Load mẫu vào giếng, nếu chạy nhiều mẫu nhớ đánh dấu từng mẫu.
Bước 13. Phủ dầu khoáng lên trên bề mặt gel, cả 2 đầu phía ngoài điện cực.
Bước 14. Đưa khay vào máy và chạy chiều IEF theo 2 giai đoạn ở 200C, 50 A/gel là S1 250V trong 15 phút, S2 4.000V cho đến khi toàn bộ màu tập trung ở cực dương (khoảng 6 giờ).
Bước 15. Sau khi chạy IEF gần xong, tiến hành đổ gel polyacrylamide 12%. Chuẩn bị các điều kiện để chạy chiều thứ 2.
Bước 16. Pha các dung dịch cân bằng mẫu và chuẩn bị dụng cụ để cân bằng (khay hay ống nghiệm nhỏ).
8. Cân bằng mẫu
Sau khi chạy IEF xong, tắt máy, lấy khay ra và thực hiện lại bước 6 và 7.
Bước 17. Đặt thanh strip vào khay cân bằng (mặt gel lên trên) hoặc trong các ống nghiệm nhỏ, cho 2,5 ml đệm cân bằn 1 vào, lắc rất nhẹ trong khoảng 15 phút.
Bước 18. Nghiêng cẩn thận để cho đệm cân bằng 1 chảy hết ra ngoài, chú ý tránh để thanh strip chạy ra theo.
Bước 19. Thực hiện như bước 17 với đệm cân bằng 2.
Bước 20. Làm nóng chảy agarose 0,8% bằng lò vi sóng.
Bước 21. Sau 15 phút ngâm bởi đệm cân bằng 2, lấy gel ra và cho vào ống nghiệm đựng khoảng 40 - 50 ml đệm chạy (Tris-glycine-SDS) để rửa sạch.
Sau khoảng 10 phút, lấy gel ra và thực hiện theo 2 bước 6 và 7.
9. Chạy chiều SDS
Bước 22. Dùng panh đặt thanh strip lên tấm kính lớn phía trên gel polyacrylamide (mặt phim áp vào kính). Dùng panh hoặc lược đẩy nhẹ thanh strip xuống đến khi tiếp xúc với gel polyacrylamide.
Bước 23. Dùng pipette cho agarose nóng chảy lên trên gel polyacrylamide, chú ý không để xuất hiện bong bóng khí ở tất cả các vị trí tiếp xúc (nên để gel hơi nghiêng khi cho agarose vào). Tiếp tục phủ agarose lên trên thanh strip.
Bước 23. Đưa gel vào buồng điện di, chạy điện di với điện thế 80 - 100 V trong khoảng 1 - 2,5 giờ.
Bước 24. Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ nhuộm bạc.
10. Nhuộm gel (bằng kit nhuộm bạc)
Bước 25. Sau khi chạy chiều SDS xong, lấy gel ra, cho vào dung dịch cố định, lắc nhẹ trong 20 phút.
Bước 26. Rửa lại gel 2 lần bằng nước cất 2 lần, mỗi lần 10 phút.
Bước 27. Đổ nước đi, thêm thuốc nhộm bạc vào, canh cho đến khi gel bắt màu là dừng phản ứng ngay (sau khoảng 5 phút) bằng acetic acid 5%.
11. Chụp ảnh.
Tài liệu tham khảo
1. Nguyễn Văn Mùi, 2001. “Thực hành Hóa sinh học”. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Biorad Laboratories, 2000. “PROTEAN IEF Cell”. Instruction Manual (Catolog # 165-4000).
3. Biorad Laboratories, 2005. “ReadyStrip IPG Strip”. Instruction Manual (Catolog # 163-2099).
4. Bollag DM, Rozycki MD, Edelstein SJ. Protein method. Wiley-liss, Inc.USA. 58-61
5. Garfin D., Heerdt L. et al, 2003. “2-D Electrophoresis for Proteomics” (Biorad). [You must be registered and logged in to see this link.]
6. Hirata Y., 2004. Protocols of Training course plant biotechnology. Hue, 31st May - 7th June.
7. Holloway P.J, Arudel P.H., 1988. “High - resolution two - dimension electrophoresis of plant protein”. Analyt bioche, 172, 8 - 15.
8. Kang T.J., Loc N.H., Jang M.O., Jang Y.S., Kim Y.S., Seo J.E., Yang M.S., 2003. “Expression of the B subunit of E.coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization”, Trans Res, PC-1189: 1-9.
9. Pharmacia biotech, 2000. “Immobiline Dry Strip Kit for 2 - D Electrophoresis with Immobiline Dry Strip and ExcelGel SDS”. Instructions.
10. Yang M.S., 2004. “Training cource on introduction to theory and practice in the fields of molecular biology”. Hue, 23/2 - 5/3/2004.
* Các dung dịch stock
1. Urea 11 M:
Pha 39,6 g urea trong 60 mL nước cất vô trùng bằng cách cho từ từ urea vào 20 mL nước, đánh tan trên máy khuấy từ, sau khi tan hết (khoảng 2 giờ) định mức lên 60 mL.
Chú ý không để urea ở nhiệt độ trên 300C, bảo quản dung dịch stock ở -200C.
2. Tris - HCl 1,5 M pH 8,8
Pha 3,64 g Tris trong 15 mL nước cất vô trùng, chỉnh pH 8,8 với HCl, định mức lên 20 mL bằng nước cất vô trùng.
3. EDTA 0,25 M pH 8
Pha 4,2 g EDTA trong khoảng 40 mL nước cất vô trùng, chỉnh pH 8 với NaOH khan, định mức 50 mL bằng nước cất vô trùng.
* Đệm chiết
1. Đệm dẫn theo Kang và cs [8]
Nồng độ Pha trong 20 mL đệm
HEPES 50 mM 0,238 g
Potassium acetate 10 mM 0,019 g
Magnesium acetate 5 mM 0,014 g
EDTA 1 mM 136 L EDTA 0,25 M.
DTT 1 mM 0,003 g
PMSF 2 mM 0,007 g
2. Đệm PBS [1]
NaCl 8 g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,44 g
KH2PO4 0,24 g
Pha trong 1 lít dung dịch, pH 7,4 (NaOH).
3. Đệm Gabriel và Ellingboe (1982) [7]
Tris/HCl 50 mM
MgCl2 0,5 mM
Na2-EDTA 1 mM
SDS 2%
Dithiothreiton (DTT) 50 mM
pH 7,8.
4. Đệm Arakawa (1997) [10]
Nồng độ Pha trong 20 mL đệm
Tris - HCl (pH 8,0) 200 mM 4 mL Tris 1 M
NaCl 100 mM 0,12 g
Sucrose 400 mM 2,47 g
EDTA 10 mM 0,8 mL EDTA 0,25 M
2 - mercaptoethanol 14 mM 15,58 L
PMSF 1 mM 4,84 mg
Tween 20 0,05% 10 L
* Các dung dịch khác
1. TCA acetone [6]
Trichloacetic acid 10% 10 g
2 - mercaptoethanol 0,07% 0,07 mL
Hòa tan và định mức 100 mL bằng acetone, bảo quản ở 4oC.
2. Đệm rửa mẫu [6]
2 - mercaptoethanol 0,07% 0,07 mL
Acetone 100 mL
Bảo quản ở 4oC.
* Các bước tiến hành [6], [7]
Đối với mẫu lá, lá cây được chọn từ ruộng, rửa sạch và cắt nhỏ sau đó để trong tủ lạnh -860C khoảng 1 ngày trước khi tách chiết (0,3 g lá/mẫu).
Nghiền thật mịn mẫu lá bằng chày và cối sứ (cối và chày sứ đều được làm lạnh từ trước cùng với mẫu lá) trong 1 mL đệm chiết. Sau khi nghiền, mẫu được chuyển qua các tube eppendorf 1,5 mL và được ly tâm với tốc độ 15.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Sau khi ly tâm, kết tủa bị loại bỏ, phần dịch nổi có chứa protein được chuyển qua 1 tube khác. Mẫu sau khi ly tâm được bảo quản ở -200C.
Đối với hạt có chứa tinh bột, các bước tiến hành cũng giống như mẫu lá, tuy nhiên dịch nổi sau khi ly tâm lần thứ nhất được đun ở 950C trong vòng 5 phút, tiếp tục ly tâm 15.000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ tủa tinh bột, thể nổi có chứa protein được giữ lại.
* Tinh sạch protein [6]
Với các mẫu bị lẫn tạp chất hay nồng độ protein thấp có thể tinh sạch bằng cách cho TCA - acetone vào mẫu, vortex nhẹ, để lắng ở -20oC trong khoảng 30 phút. Mẫu sau đó được ly tâm nhẹ khoảng 1.000 vòng/phút trong khoảng 30 giây, loại bỏ nổi. Cho thêm acetone có chứa 2 mercaptoethanol vào mẫu, vortex nhẹ và thực hiện như bước trên, làm như vậy nhiều lần cho đến khi thấy mẫu có màu trắng. Làm khô mẫu bằng máy làm khô chân không, hòa tan mẫu trở lại với lượng đệm phù hợp.
* Xác định hàm lượng protein tổng số [4]
Dịch nổi có chứa protein được đo độ hấp thụ quang trên máy quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm (mẫu trắng là đệm chiết protein).
Nồng độ protein tổng số được tính theo công thức của Schlef và Wensink (1981).
PC (mg/ml) = 1,5 x A280 – 0,75 x A260
Trong đó:
PC : nồng độ protein
A280 : độ hấp thụ quang ở bước sóng 280 nm
A260 : độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm
SDS Electrophoresis protocol
* Hóa chất
1. Acrylamide 30%
Acrylamide 29 g
Bisacrylamide 1 g
Định mức 100 mL bằng nước cất 2 lần
Bảo quản 4oC
2. Tris 2 M (pH 8,
Tris base 121 g
Nước cất 2 lần 300 mL
Chỉnh pH = 8,8 bằng HCl đậm đặc
Định mức 500 ml bằng nước cất 2 lần
3. SDS 10%
SDS 10 g
Định mức 100 mL với nước cất 2 lần
4. APS 10%
APS 1g
Định mức 10 mL với nước cất 2 lần
5. TEMED
Bảo quản ở 4oC
6. 4X separating gel pH 8,8
Tris 2M pH 8,8 75 mL
SDS 10% 4 mL
Định mức 100 mL với nước cất 2 lần
7. 4X stacking gel pH 6,8
Tris 2M pH 8,8 25 mL
Nước cất 2 lần 25 mL
Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc
SDS 10% 4 mL
Định mức 100ml với nước cất 2 lần
8. 2X SDS sample buffer
Tris 2M pH 8,8 6,25 mL
Nước cất 2 lần 30 mL
Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc
SDS 4 g
Glycerol 20 mL
β- mercaptoethanol 10 mL
Bromophenol blue 0,2 g
Định mức với nước cất 2 lần tới 100 mL
Bảo quản ở -20oC
9. 10X Electrophresis buffer pH 8,3
Tris base 30 g
Glycine 144 g
SDS 10 g
Nước cất 2 lần 1000 mL
Chỉnh pH = 8,3 bằng HCl đậm đặc
10. Gel staining
Coomassie brilliant blue R250 2,5 g
Methanol 450 mL
Glacial acid acetic 100 mL
Nước cất 2 lần 450 mL
11. Gel destaining
Methanol 300 mL
Glacial acetic acid 100 mL
Nước cất 2 lần 600 mL
* Các bước tiến hành
1. Đổ gel
Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất.
Bước 2: Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thật sạch bằng nước cất. Gắn các tấm kính vào giá đỡ. Thử độ thấm lắp ghép bằng nước cất, nếu nước chảy ra từ khe ghép nhiều thì phải làm lại.
Bước 3: Pha dung dịch separating gel 12%.
Chạy 1 chiều Chạy 2 chiều
DW 1,68 mL 2,94 mL
Acrylamide 1,92 mL 3,36 mL
Separating buffer 1,2 mL 2,1 mL
TEMED 6 L 8 L
APS 30 L 35 L
Vortex khoảng 1 - 2 phút, đổ nhanh vào giữa 2 tấm kính đã chuẩn bị sẵn lên đến hơn 3/4 độ cao tấm kính. Cho nhanh nước cất vô trùng vào bên trên gel. Sau khi đông (kiểm tra bằng dung dịch thừa ở ngoài hoặc thấy vạch phân cắt ở 2 pha trên gel), nghiêng gel lại cho nước chảy ra hết và làm khô bề mặt gel bằng giấy thấm.
Bước 4: Pha dung dịch stacking gel 5%
DW 0,88 mL
Acrylamide 260 L
Stacking buffer 380 L
TEMED 2 L
APS 12 L
Vortex khoảng 1 phút, đổ nhanh vào giữa 2 tấm kính, bên trên separating gel cho hết độ cao tấm kính. Cẩn thận đặt lược vào giữa 2 tấm kính sao cho không có bọt khí. Theo dõi gel đông, cứ khoảng 2 phút dùng pipette thêm stacking gel vào phía trên lược để bổ sung lương gel bị chảy ra ngoài (nếu có).
2. Chuẩn bị mẫu
Bước 5: Tính toán lấy 1 mẫu chứa khoảng 30 mg protein và 5 mL sample buffer, tổng thể tích mẫu khoảng 30 mL.
3. Chạy điện di
Bước 6: Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập bằng đệm chạy (1X Electrophoresis buffer). Chú ý không để bọt khí ở phía dưới tấm kính, dùng pipette làm sạch gel thừa trong các giếng. Chạy prerun khoảng 5 phút ở 80 - 100 V.
Bước 7: Dùng Hamilton syringe load mẫu vào các giếng, cẩn thận để mẫu không bị tràn ra ngoài.
Bước 8: Chạy điện di ở điện thế 80 - 100 V trong khoảng từ 1,5 - 2,5 giờ cho đến khi vạch màu đi hết độ dài tấm kính (thời gian thay đổi tùy theo mẫu).
4. Nhuộm và rửa gel
Bước 9: Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm (thường là các hộp nhựa) có chứa dung dịch gel staining, lắc nhẹ khoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10 - 15 phút.
Bước 10: Rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ, khoảng 10 phút thay dung dịch rửa 1 lần cho đến khi hoàn thành.
2 D Electrophoresis protocol
(for IPG ReadyStrip pH 4-7, 7 cm)
* Hóa chất
1. Sample solution [9]
25 mL 1 mL
Urea 13,5 g 820 mL 11 M
Trixton - 100 0,13 mL 5,5 mL
2 - mercaptoethanol 0,5 mL 20 mL
Amphalyte 0,5 mL 20 mL
DW Định mức 25 mL 135 mL
Pha 1 mL cho khoảng 6 mẫu, cho thêm vài hạt Bromophenol Blue (BPB) và bảo quản ở -200C (có thể đến 2 tháng).
2. Rehydration solution [2], [3]
Nồng độ 1 mL
Urea 9 M 820 mL 11 M
Trixton - 100 0,5% 5 mL
Amphalyte 0,15% 3,75 mL
DTT 10 mM 1,5 mg
DW 170 mL
Pha ngay trước khi dùng, 1 mL đệm cho 1 - 3 thanh strip.
3. Equilibration buffer [2], [3]
Nồng độ 2,5 mL
Urea 6 M 1.400 mL 11 M
Tris - HCl 0,375 M 625 mL 1,5 M
Glycerol 20% 500 mL SDS 2% 50 mg
Đối với Equilibration solution 1, thêm 50 mg DTT (130 mM)
Đối với Equilibration solution 2, thêm 62,5 mg Iodoacetamide (135 mM).
Pha ngay trước khi dùng, sử dụng 2,5 mL mỗi loại cho mỗi thanh strip.
* Các bước tiến hành [3], [5]
Ngày 1 (có thể chuẩn bị từ trước):
1. Pha các dung dịch stock.
2. Pha các hóa chất cần thiết.
3. Chuẩn bị mẫu.
Ngày 2:
4. Kiểm tra mẫu bằng điện di SDS 12% acrylamide, chọn mẫu tốt để chạy điện di 2 chiều.
5. Pha đệm trương nước (Rehydration buffer). Tiến hành vào khoảng 15h30 đến 16h00 chiều.
6. Ngâm trương nước thanh strip.
Bước 1. Rửa sạch khay trương nước (Rehydration tray) bằng cồn và nước cất 2 lần.
Bước 2. Dùng pipette cho khoảng 300 - 1000 l đệm trương nước vào khay trương nước.
Bước 3. Lấy thanh strip ra khỏi tủ -200C, cẩn thận dùng panh tách lớp phim bảo vệ trên thanh strip sau đó đặt vào khay đã có sẵn đệm trương nước. Chú ý đặt mặt gel xuống dưới một cách nhẹ nhàng, nếu phía dưới gel có bọt khí phải dùng panh giữ 1 đầu thanh strip, nâng lên hạ xuống nhẹ nhàng cho bọt khí ra hết.
Bước 4. Đậy nắp khay (hoặc phủ dầu khoáng), ngâm qua đêm ở 200C.
Ngày 3:
7. Chạy chiều IEF
Bước 5. Chuẩn bị mẫu, tỷ lệ mẫu : sample loading ít nhất là 1:4 (nếu trong mẫu có nhiều muối thì tỷ lệ này phải cao hơn, thường là 1:5) và tổng thể tích không vượt quá 200 L.
Bước 6. Chuẩn bị một miếng giấy thấm khô và một miếng giấy thấm được làm ẩm (tốt nhất là giấy 3M). Chuẩn bị 2 miếng giấy wick được làm ẩm bằng nước cất 2 lần.
Bước 7. Dùng panh nhấc 1 đầu của thanh strip ra khỏi khay trương nước, giữ theo chiều thẳng đứng vài giây cho đệm thừa chảy ra hết. Sau đó đặt thanh strip lên miếng giấy thấm khô (mặt phim xuống dưới) và đặt miếng giấy thấm ẩm lên trên mặt gel của thanh trong vài giây để hút hết đệm thừa.
Bước 8. Đặt thanh strip vào focusing tray 24 cm (mặt phim xuống dưới), chỉnh vị trí của thanh sao cho đúng vị trí điện cực, cẩn thận tránh nhầm cực.
Bước 9. Cẩn thận đặt 2 miếng wick vào 2 đầu của thanh strip ở vị trí khoảng 5 mm tính từ mép của gel ở trên mỗi đầu (với các miếng wick nhỏ có thể dùng nhiều miếng).
Bước 10. Đặt các điện cực di động vào vị trí tương ứng của wick và gel ở 2 đầu thanh strip, luôn đảm bảo điện cực không nằm phía ngoài gel và wick nằm giữa gel và điện cực.
Bước 11. Cẩn thận đặc các giếng lên thanh strip ở vị trí sát điện cực âm sao cho vừa không làm hỏng gel vừa không tạo kẽ hở để mẫu chảy ra ngoài.
Bước 12. Load mẫu vào giếng, nếu chạy nhiều mẫu nhớ đánh dấu từng mẫu.
Bước 13. Phủ dầu khoáng lên trên bề mặt gel, cả 2 đầu phía ngoài điện cực.
Bước 14. Đưa khay vào máy và chạy chiều IEF theo 2 giai đoạn ở 200C, 50 A/gel là S1 250V trong 15 phút, S2 4.000V cho đến khi toàn bộ màu tập trung ở cực dương (khoảng 6 giờ).
Bước 15. Sau khi chạy IEF gần xong, tiến hành đổ gel polyacrylamide 12%. Chuẩn bị các điều kiện để chạy chiều thứ 2.
Bước 16. Pha các dung dịch cân bằng mẫu và chuẩn bị dụng cụ để cân bằng (khay hay ống nghiệm nhỏ).
8. Cân bằng mẫu
Sau khi chạy IEF xong, tắt máy, lấy khay ra và thực hiện lại bước 6 và 7.
Bước 17. Đặt thanh strip vào khay cân bằng (mặt gel lên trên) hoặc trong các ống nghiệm nhỏ, cho 2,5 ml đệm cân bằn 1 vào, lắc rất nhẹ trong khoảng 15 phút.
Bước 18. Nghiêng cẩn thận để cho đệm cân bằng 1 chảy hết ra ngoài, chú ý tránh để thanh strip chạy ra theo.
Bước 19. Thực hiện như bước 17 với đệm cân bằng 2.
Bước 20. Làm nóng chảy agarose 0,8% bằng lò vi sóng.
Bước 21. Sau 15 phút ngâm bởi đệm cân bằng 2, lấy gel ra và cho vào ống nghiệm đựng khoảng 40 - 50 ml đệm chạy (Tris-glycine-SDS) để rửa sạch.
Sau khoảng 10 phút, lấy gel ra và thực hiện theo 2 bước 6 và 7.
9. Chạy chiều SDS
Bước 22. Dùng panh đặt thanh strip lên tấm kính lớn phía trên gel polyacrylamide (mặt phim áp vào kính). Dùng panh hoặc lược đẩy nhẹ thanh strip xuống đến khi tiếp xúc với gel polyacrylamide.
Bước 23. Dùng pipette cho agarose nóng chảy lên trên gel polyacrylamide, chú ý không để xuất hiện bong bóng khí ở tất cả các vị trí tiếp xúc (nên để gel hơi nghiêng khi cho agarose vào). Tiếp tục phủ agarose lên trên thanh strip.
Bước 23. Đưa gel vào buồng điện di, chạy điện di với điện thế 80 - 100 V trong khoảng 1 - 2,5 giờ.
Bước 24. Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ nhuộm bạc.
10. Nhuộm gel (bằng kit nhuộm bạc)
Bước 25. Sau khi chạy chiều SDS xong, lấy gel ra, cho vào dung dịch cố định, lắc nhẹ trong 20 phút.
Bước 26. Rửa lại gel 2 lần bằng nước cất 2 lần, mỗi lần 10 phút.
Bước 27. Đổ nước đi, thêm thuốc nhộm bạc vào, canh cho đến khi gel bắt màu là dừng phản ứng ngay (sau khoảng 5 phút) bằng acetic acid 5%.
11. Chụp ảnh.
Tài liệu tham khảo
1. Nguyễn Văn Mùi, 2001. “Thực hành Hóa sinh học”. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Biorad Laboratories, 2000. “PROTEAN IEF Cell”. Instruction Manual (Catolog # 165-4000).
3. Biorad Laboratories, 2005. “ReadyStrip IPG Strip”. Instruction Manual (Catolog # 163-2099).
4. Bollag DM, Rozycki MD, Edelstein SJ. Protein method. Wiley-liss, Inc.USA. 58-61
5. Garfin D., Heerdt L. et al, 2003. “2-D Electrophoresis for Proteomics” (Biorad). [You must be registered and logged in to see this link.]
6. Hirata Y., 2004. Protocols of Training course plant biotechnology. Hue, 31st May - 7th June.
7. Holloway P.J, Arudel P.H., 1988. “High - resolution two - dimension electrophoresis of plant protein”. Analyt bioche, 172, 8 - 15.
8. Kang T.J., Loc N.H., Jang M.O., Jang Y.S., Kim Y.S., Seo J.E., Yang M.S., 2003. “Expression of the B subunit of E.coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization”, Trans Res, PC-1189: 1-9.
9. Pharmacia biotech, 2000. “Immobiline Dry Strip Kit for 2 - D Electrophoresis with Immobiline Dry Strip and ExcelGel SDS”. Instructions.
10. Yang M.S., 2004. “Training cource on introduction to theory and practice in the fields of molecular biology”. Hue, 23/2 - 5/3/2004.
