XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE

Mục lục:


1.
MỞ ĐẦU...................................................................................................................... 1


1.1.Đặt vấn
đề ............................................................................................................ 2


1.2.Mục đích
yêu cầu................................................................................................
3


2.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................................ 3


2.1. Giới thiệu
tổng quan về cây cacao ................................................................... 3


2.1.1. Nguồn
gốc cây cacao................................................................................. 3


2.1.2. Đặc
điểm hình thái..................................................................................... 3


2.1.3.Yêu cầu
sinh thái........................................................................................ 5


2.1.4. Các giống
cacao ........................................................................................ 5


2.1.4. Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu
trong đề tài............... 6


2.2. Qui trình
ly trích DNA ở tế bào thực vật ......................................................... 6


2.3. Giới thiệu
về kỹ thuật PCR................................................................................ 8


2.3.1. Nguyên
tắc của kỹ thuật PCR .................................................................. 8


2.3.2. Tối ưu
hóa các điều kiện cho phản ứng PCR ........................................ 10


2.3.2.1. DNA
mẫu..................................................................................... 10


2.3.2.2. Taq polymerase .......................................................................... 10


2.3.2.3.
Primer .......................................................................................... 11


2.3.2.4.
Nhiệt độ bắt cặp.......................................................................... 13


2.3.2.5. Tỉ lệ
primer/DNA khuôn mẫu .................................................. 14


2.3.2.6. Các
thành phần khác.................................................................. 14


2.3.2.7. Số
lượng chu kỳ phản ứng PCR ................................................ 15


2.3.2.8. Thiết
bị và dụng cụ trong phản ứng PCR ................................ 15


2.3.3. Các
vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết...... 16


2.3.4. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR .......................................................... 17


2.4. Giới thiệu về phương pháp phân tích trình tự DNA...................................... 19


2.5. Giới thiệu
về Microsatellite .............................................................................. 20


2.5.1. Khái
niệm về Microsatellite .................................................................... 20


2.5.2. Các
loại Microsatellite ............................................................................. 20


2.5.3. Cơ chế hình thành Microsatellite ........................................................... 21


2.5.4. Vai trò của Microsatellite ........................................................................ 22


2.5.5. Các phương pháp phát hiện Microsatellite ........................................... 24


2.5.5.1.Phương pháp lai.................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... 24


2.5.5.2.Phương pháp PCR................................................................................ 24


2.5.6.Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer PCR.......................... 25


2.5.6.1.Khả năng chuyển đổi primer
microsatellite giữa các loài.............. 27


2.5.6.2.Thiết kế primer
microsatellite........................................................... 28


2.5.7.Ưu, khuyết điểm của phương pháp microsatellite so vớ
các phương pháp khác 29


2.5.8. Những ứng dụng của nghiên cứu Microsatellite ................................... 30


2.6. Các công
trình nghiên cứu có liên quan.......................................................... 31


2.6.1. Kiểm
tra tính đồng nhất di truyền của Theobroma
cacao bằng Microsatellite marker
31


2.6.2. Nghiên
cứu fingerprinting DNA của cacao sử dụng
Microsatellite marker 32


3.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 35



Vật liệu......................................................................................................................... 35


3.1.1. Các
giống cacao thí nghiệm ..................................................................... 35


3.1.2. Hóa
chất thí nghiệm................................................................................... 37


3.1.2.1.
Primer .......................................................................................... 37


3.1.2.2. Các hóa chất dùng trong ly
trích DNA..................................... 38


3.1.2.3. Các hóa chất dùng trong phản
ứng PCR.................................. 38


3.1.2.4. Các hóa chất dùng trong phân
tích trình tự............................. 38


3.1.3. Thiết bị thí nghiệm...................................................................................... 39



Phương pháp ............................................................................................................... 39


3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 39


3.2.2. Bố trí thí nghiệm........................................................................................ 39


3.2.3. Kỹ thuật ly trích DNA................................................................................ 41


3.2.4. Kiểm tra định lượng và định tính DNA.................................................. 42


3.2.4.1.Định tính DNA bằng phương
pháp điện di.............................. 42


3.2.4.2.Định lượng DNA bằng quang phổ
kế.......................................... 42


3.2.5. Qui trình phản ứng Microsatellite .......................................................... 42


3.2.5.1.Phản ứng PCR với 1 cặp primer............................................... 42


3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3
cặp primer.............................. 43


3.2.6.Điện di
sản phẩm PCR.............................................................................. 45


3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự
bằng máy giải trình tự DNA................ 45


3.2.8.Phương pháp nhận diện bằng phần mềm Cervus................................... 46


3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa
dạng di truyền bằng phần mềm Genetix


4.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................................... 50


4.1.Sản phẩm DNA li trích........................................................................................ 50


4.2.Sản phẩm PCR...................................................................................................... 51


4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao....................................... 52


4.4.Kết quả nhận diện các mẫu được mã hóa......................................................... 55


4.5. So
sánh dữ liệu microsatellite .......................................................................... 58


4.6.Kết quả phân tích multiplex PCR...................................................................... 59


4.7. Kết quả
phân tích tính đa dạng di truyền........................................................ 61


5.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................................... 63


6.
PHỤ LỤC..................................................................................................................... 65


7.
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 83



Địa chỉ download tài liệu: [You must be registered and logged in to see this link.]